Q1：纳微核酸提取磁珠的粒径是多少？

• A1：纳微核酸提取磁珠（MS系列磁性氧化硅磁珠）的粒径主要是300 - 600 nm。

Q2：纳微核酸提取磁珠可以常温保存吗？

• A2：可以常温保存，MagneStar^® MS500-SiOH磁珠目前常温保存的效期在2年。

Q3：纳微核酸提取磁珠是否可以用乙醇保存？

• A3：可以使用乙醇保存，为保证磁珠分散性，需要进行多次保存液置换。

Q4：不同批次的磁珠为什么颜色不同，有的批次颜色偏红？

• A4：MageneStar^®系列磁珠由于内部存在磁性材料，外部包覆了二氧化硅或聚合物包层，故外观一般呈现为棕色至棕褐色。磁性微球内部的磁性材料一般为Fe₃O₄及γ-Fe₂O₃混合的形式，使得磁珠具备铁磁性或超顺磁性。Fe₃O₄呈黑色，γ-Fe₂O₃呈红褐色，磁性材料中Fe₃O₄的占比越高则微球的外观颜色更深。新制的磁性微球一般呈深棕褐色。随着放置时间的变化，Fe₃O₄在空气中逐步氧化为γ-Fe₂O₃。该转化过程不会导致磁珠的分散性、磁响应时间等基本理化性质发生变化，对磁珠的产品性能也不产生任何影响。

Q5：纳微的核酸提取磁珠有哪几种表面基团可选，一般如何选择，这些基团都有什么区别？

• A5：MagneStar^® MS系列磁珠主要用于核酸提取，有三种不同表面基团的磁珠可以选择，分别是：硅羟基、羧基和氨基。

  提取基因组、质粒、cfDNA建议使用硅羟基磁珠，对于病毒核酸、PCR产物纯化建议使用羧基磁珠。氨基磁珠可以通过调节pH实现核酸分子在表面的可逆结合，但由于正电荷表面对核酸分子吸附过强，容易导致收率偏低，因此正电荷磁珠的使用反而不如硅羟基及羧基磁珠广泛。这些基团的区别是使用不同工艺在氧化硅表面修饰羟基、羧基和氨基。

Q6：纳微核酸提取磁珠一般适用于哪些样本的核酸提取？

• A6：纳微核酸提取磁珠适用于从血浆、血清、全血、尿液、分泌液、细胞培养上清液、病毒保存液、植物、FFPE等样本中提取DNA/RNA。

Q7：羧基氧化硅磁珠与羟基氧化硅磁珠进行核酸提取的作用机理有什么不同？

• A7：1）硅羟基磁珠:这是一类使用最为广泛的磁珠。使用硅羟基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的离液盐（NaCl、NaClO₄、GuHCl、GuSCN等）。高浓度的盐离子能够有效屏蔽溶液中的静电斥力。同时，离液盐离子还能竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合，破坏二者表面原有的水化层，促进磁珠表面与核酸分子的吸附（氢键+范德华力）。

  2）羧基磁珠:这类磁珠除了能够像硅羟基磁珠一样在高浓度离液盐环境中结合核酸分子之外，还能通过另一种特殊的机制与核酸分子结合。通过向溶液中加入一定浓度的PEG和NaCl，可以使得核酸分子从伸展的构象逐渐蜷缩成小球状，其上的负电荷也大部分被屏蔽掉，促使核酸分子吸附到磁珠上。核酸分子的分子量越大，越倾向于发生这种从伸展线团向蜷缩小球的构象变化，因此，通过调节盐溶液与核酸样本的体积比，能够实现较大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的优先吸附，达到所谓的片段筛选效应。

Q8：核酸提取磁珠一般推荐在胍盐体系还是PEG体系中使用？

• A8：MS500-SiOH一般推荐胍盐体系，MS500-COOH一般推荐PEG体系。

Q9：我们提取cfDNA，推荐用哪一款磁珠，提取效率怎么样？

• A9：推荐使用MagneStar® MS500-SiOH磁珠，血清标准品的回收率可达80%以上。

Q10：我们提取全血基因组DNA，推荐用哪一款磁珠，提取效率怎么样？

• A10：推荐使用MagneStar^® MS500-SiOH磁珠，从200 μL的血液中可以提取2-6 μg基因组DNA。

Q11：是否可以用Nanodrop测A280检测蛋白的残留？

• A11：与人们普遍认为A260/A280在评估蛋白质污染时的作用相反，A260/A230是蛋白质污染的更敏感指标。如果A260/A280反映了蛋白质污染的迹象，则存在相对大量的蛋白质。这意味着在低核酸浓度下，蛋白质污染对纯度比有很大影响，但在高核酸浓度下可能很难检测到，会导致蛋白污染的影响被低估。

Q12：如何确定核酸提取磁珠用量？是否提取磁珠用量越多越好？

• A12：对于常规样本核酸提取，我们推荐客户初始磁珠用量在1-2 mg/test，客户可以根据实际使用情况对磁珠用量进行优化。

  磁珠用量并非越多越好。磁珠用量过多，会导致其无法均匀分散到液体中，降低其分散性，导致吸附、洗涤和洗脱过程的不彻底。过量的磁珠也会吸附更多的杂质，磁珠表面没有结合核酸的位点，会给杂质的结合提供更多机会。一般情况下，我们推荐的磁珠用量都足够满足常见的应用场景，如果遇到核酸提取收率低的问题，需要对裂解结合、洗涤和洗脱过程等方面进行考虑。

Q13：纳微的核酸提取磁珠是否进行无菌处理？

• A13：可根据客户需求进行无菌处理。

Q14：是否可以带磁珠进行直接扩增？

• A14：可以带磁珠进行直接扩增，但需要客户自行适配磁珠用量。低浓度磁珠对PCR的抑制很少，甚至可略微增强PCR反应效率，但随着磁珠浓度增加，对PCR抑制作用显著上升。

Q15：MP1-Select磁珠是否含有核酶及内毒素？

• A15：经检测MP1-Select磁珠无DNA酶、无RNA酶、无内毒素

Q16：MS500-COOH磁珠在PCR产物纯化的应用场景中适合回收的片段大小？

• A16：适合回收100 bp以上的DNA，回收效率＞80 %。

Q17：我们提取病毒核酸，推荐用哪一款磁珠？

• A17：推荐使用MS300-SiOH或MS500-COOH。

Q18：MageneStar系列的磁珠保存液是什么？

• A18：MageneStar系列磁珠储存于含有0.05 % w/v Proclin 300抑菌剂的纯水中。

Q1：我要进行化学发光试剂开发，羧基磁珠与Tosyl磁珠相比优劣势如何？

• A1: 我们可以从磁珠表面性质、偶联工艺以及平台适用性3个方面进行比较。

  1） 磁珠表面性质：羧基磁珠表面更亲水且存在一定的电荷密度，磁珠本身分散性好，对于蛋白的非特异吸附相对较低；甲苯磺酰基磁珠表面较为疏水，磁珠混匀后仍可能存在少量粘连，对于蛋白的非特异吸附相对较高，需要充分的封端及封闭工艺来降低试剂的本底；

  2） 偶联工艺：

  ①羧基磁珠需要用EDC或EDC+Sulfo-NHS等交联剂进行活化，活化后的产物不太稳定易水解，需立即和抗体或抗原进行偶联，一般在弱酸-中性pH下进行活化和偶联，偶联反应时间为2-4 h。但是EDC和Sulfo-NHS容易水解，且活化产物与氨基的反应速度很快，在工艺放大中容易出现较大的批间差。

  ②甲苯磺酰基磁珠偶联蛋白是通过疏水作用使蛋白向磁珠靠近，不需要使用交联剂，一般在中性-弱碱性pH下进行偶联，偶联反应时间为16-24 h，需在高温下进行。该偶联反应较慢，因此相对COOH磁珠更易控制，批间差也更小，但要注意磁珠需提前充分混匀。

  3） 平台适用性：羧基磁珠可以用于吖啶酯、AP、HRP等平台，甲苯磺酰基磁珠由于相较羧基磁珠具有更高的非特异吸附建议使用在AP、HRP平台。原则上，在客户使用纳微的羧基或甲苯磺酰基磁珠时，建议应当在其原先工艺上做一定的优化，而不是直接套用原有工艺。

  
  

Q2：MagneStar MP系列磁性聚合物微球表面的羧基、tosyl、氨基等基团含量是如何测定的？

• A2：对于微球表面基团含量的测定，我们制定了严格的标准操作流程确保测试结果的可重复性。

  1）羧基：通过电导率滴定法测定。

  2）Tosyl（甲苯磺酰基）：通过乙醇胺与Tosyl基团的反应将Tosyl基团置换回溶液中进行测定，利用紫外分光光度计测定Tosyl的基团密度。

  3）氨基：通过电导率滴定法测定。

  
  

Q3：我们需要在磁珠表面包被抗原，应该选择哪种磁珠？

• A3：需要根据抗原的亲疏水性、等电点、分子量等方面进行综合考虑，一般分子量大于100 kDa可以尝试直接偶联至磁珠，分子量低于100 kDa则建议引入SA-Biotin体系，对小分子抗原预先进行生物素化。

  
  

Q4：1.5μm/3.0μm/5.5μm磁珠，以固含2%为例，1mL中含有多少个粒子？

• A4：1） 1.5 μm磁珠：1.0*10¹⁰~1.5*10¹⁰个/mL

  2）3.0 μm磁珠：1.2*10⁹~1.8*10⁹个/ mL

  3）5.5 μm磁珠：1.5*10⁸~2.0*10⁸个/ mL

  
  

Q5：MP1-Streptavidin HC，生物素结合能力如何？

• A5：1）小分子生物素荧光素结合能力在2500-3500 pmol/mg，

  2）生物素化抗体的结合能力在15-25 ug/mg。

  
  

Q6：MagneStar MP系列磁性聚合物微球的悬浮性能如何？

• A6：悬浮性能满足试剂开发要求，未出现过因在工作液中沉降过快而导致测试精密度变差的情况。

  
  

Q7：MagneStar MP系列磁性聚合物微球，使用前是否需要清洗，如何清洗？

• A7：纳微羧基及甲苯磺酰基磁珠保存在去离子水中，SA磁珠保存液为1XPBS+1%BSA+0.05%Proclin-300。

  使用前建议客户进行清洗置换Buffer。

  清洗方法：

  1）将磁珠从冰箱中取出，置于血液混匀仪上混匀至少30 min，用移液枪取所需使用的磁珠；

  2）置于磁力架上磁吸分离除去上清液；

  3）加入对应体积的缓冲液（客户的磁珠稀释液或洗涤液），涡旋混匀（大量则需要搅拌混匀）后水浴超声1分钟，超声功率为40 kHz；

  4）按2）3）步骤的方法清洗磁珠三次，最后将磁珠置换至客户需要的缓冲液中。

  
  

Q8：MagneStar MP系列磁性聚合物微球，不同批次间粒径的CV是多少？保质期多久？

• A8：不同批次间粒径cv小于5%。2-8℃条件下保存，保质期为：

  1）羧基/甲苯磺酰基磁珠：3年

  2）链霉亲和素磁珠：2年

  
  

Q9：纳微的化学发光磁珠，在哪些平台及项目上做过应用测试？

• A9：1）MP1-Streptavidin（1.5 μm链霉亲和素磁珠）和 MP3-Streptavidin（3.0 μm链霉亲和素磁珠）在AE/AP 平台的TSH、PCT、FT4、Anti TPO项目上进行过应用测试。

  2）MP3- Tosyl（3 .0 μm甲苯磺酰基磁珠）在AP平台 TSH、PCT、IL-6和AE平台PCT、TSH项目上进行过应用测试。

  
  

Q10：Tosyl/COOH磁珠偶联抗体时，应该如何降低本底？

• A10: 在偶联反应过程得到充分混匀的前提下：针对Tosyl磁珠，可以提高封闭液中BSA浓度/延长封闭时间/调整封闭剂种类来对微球表面进行更为完整的封闭，以此来降低上机过程中的非特异吸附，降低试剂的本底；针对COOH磁珠，可以尝试使用Blockmaster类的封闭剂来降低由电荷相互作用导致的非特异吸附，降低试剂本底。

  
  

  
  

Q11：Tosyl/COOH磁珠偶联抗体时，发现有一些磁珠小颗粒聚集在泡沫里，这是为什么？

• A11: 这是由于磁珠混匀的过程过于剧烈并且由于表面活性剂的存在会导致出现泡沫，聚集在泡沫里的磁珠小颗粒是由于磁珠的部分疏水性导致其倾向于出现在表面张力最小的位置，这部分小颗粒的偶联或者封闭通常是不充分的，建议弃掉，丢弃后并不会影响试剂的性能。

  
  

Q12：Tosyl/COOH磁珠偶联抗体时，如何保证包被效率，降低批间差？

• A12：建议在偶联过程结束后，用Bradford法或BCA法来测定上清液中的蛋白浓度，用差减法计算磁珠上偶联的蛋白含量。由于在后续清洗过程中，非特异性吸附的蛋白会被清洗掉，建议同时测量清洗液中的蛋白含量，保证不同批次的蛋白偶联量一致，降低批间差。

  
  

Q13：Tosyl/COOH磁珠偶联抗体的浓度较低时，工艺批间差应该如何控制？

• A13：低的蛋白投料量常常因为取样量过小而产生批间差，如果因为试剂性能的原因必须使用低投料量，建议稀释蛋白浓度，加大取样量；或者提高单次包被量，这样可以增加总蛋白用量，确保批次之间的取样偏差较小，同时增长反应时间使得反应更充分的进行。

Q14：Tosyl/COOH磁珠偶联抗体，进行正向热加速实验，试剂本底升高，为什么？

• A14：（1）如果是正向进行热加速实验，应确保样本的存储稳定性，建议使用质控品进行测试；通常建议进行倒放的热加速实验，这样可以保证样本同时进行测试，保证结果的一致性；（2）一般热加速过程中会出现蛋白变性或脱落等现象导致测试信号值下降，同时剥离出的磁珠表面有一定疏水性可能会导致试剂的本底上升；

  
  

Q15：Tosyl/COOH磁珠偶联后的工作液放置一段时间后低浓度样本测试信号值降低，高浓度样本信号值不变，为什么？

• A15：这有可能是因为在存储过程中磁珠表面偶联的蛋白出现部分脱落，脱落的蛋白因为位阻问题会优先结合样本中的待测物，导致试剂性能下降，整体信号值变低，其中低值区变化更为明显；蛋白的脱落一般是因为偶联时蛋白并不是以共价结合的方式结合上磁珠，而是通过疏水或静电吸附产生的结合，这种情况可以通过改变洗涤条件得到改进，同时需要确认磁珠工作液是否合适，好的工作液可以有效的阻止蛋白脱落，更快的达到试剂的平衡状态。

  
  

Q16：Tosyl/COOH磁珠偶联抗体，转产放大后本底升高，为什么？

• A16：本底升高，可能是因为在放大混匀过程中，磁珠没有得到充分的偶联或者封闭，磁珠表面仍存在裸露的疏水部分，与已标记的检测抗体产生非特异性吸附，建议关注转产过程中的传热及传质效果。

  
  

Q1：如何选择合适的胶乳微球粒径？

• A1：胶乳比浊试剂选择胶乳微球遵循“大粒径提供较高的灵敏度，小粒径提供较宽的线性范围”的原则，根据项目所要求的灵敏度和线性范围进行选择。当需要同时满足高灵敏度，宽线性范围时，可以选择大小球混用，通过改变大小粒径微球的比例，控制兼顾灵敏度和线性。

  
  

Q2：我们在实验过程中，怎么确定一个合适的抗体投入量？

• A2： 研发人员都是希望尽可能减少抗体的投入量以节省成本。我们可以通过不同粒径微球对应的单层饱和吸附量作为参考上限，向下进行梯度验证，选择能够满足试剂性能要求的最小投入量。微球粒径与单层饱和吸附量对应关系见下图：

  
  

  

  （来源： Bangs）

  
  

Q3：保存在瓶子里的胶乳微球发生沉淀现象该如何处理？

• A3：通常情况下胶乳微球在 2-8℃长时间静置的情况下会由于重力的作用而发生沉淀现象，在使用前用应通过滚轴混匀或涡旋振荡的方式将微球进行重悬，我们推荐使用滚轴混匀的方式，这样产生的振荡较小，不易产生气泡，影响取球的准确性。

  
  

Q4：抗体与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？

• A4：A: 羧基微球的活化所需时间很短，一般以10-20 分钟为宜，因为所使用的交联剂EDC的水解很迅速，过长时间的活化反而会降低偶联效率。

Q5：如何选择胶乳试剂的波长？

• A5：一般胶乳试剂的波长选择在540-660 nm左右，在此区间内，胶乳试剂的吸光度随着检测波长的增加而降低，保证了试剂检测过程中吸光度不超过检测限但又保持足够的信号强度。

  
  

Q6：微球在偶联过程中发生凝集该如何处理？

• A6：微球在偶联过程中发生凝集主要分为以下几种情况：

  1）当加入交联剂后发生凝集：

  · 调整交联剂的用量，加入之后将微球充分混匀；

  · 降低微球在反应体系中的浓度；

  2）当加入抗体后发生凝集：

  · 使用探入式超声的方式尝试将试剂充分打散，如这种凝集现象未获得缓解的则不继续进行实验；、

  · 降低抗体用量或尝试使用其他偶联缓冲体系。

  
  

Q7：在乳胶微球偶联抗体封闭后，对于超声重新分散微球有什么注意事项？

• A7：一般我们在包被洗涤结束后，需要采用高速离心方式去除多余未反应的蛋白和洗涤剂，之后通过探入式超声来重新打散微球，使其保持良好的分散状态。若超声效果不足，则微球不能充分分散；若超声过度，则可能造成抗体或封闭剂从微球表面脱落，在后续长期保存中会出现聚集沉淀现象，降低试剂的稳定性。所以选择超声时间及超声强度时，可以通过紫外分光光度计来监控试剂吸光度的变化，当吸光度足够低且稳定后，可以停止超声。

  
  

Q8：在偶联反应后，发现抗体与微球偶联效率低，可能原因有哪些？

• A8：（1）建议通过BCA/Bradford等方法测定抗体结合效率；

  （2）可能是EDC受潮后活性下降，建议EDC现配现用。如果原料EDC没有问题，可以考虑调整EDC的投料量；

  （3）可能是抗体投料量不足，建议提高抗体投料量；

  （4）缓冲体系不合适，建议更换缓冲液或者调整缓冲液pH值。

  
  

Q9：微球偶联抗体发现非特异性吸附高，有什么解决办法？

• A9：（1）可能是微球表面封闭不完全，有疏水位点暴露导致非特异性吸附，建议延长封闭时间或者调整封闭剂用量及种类；

  （2）要考虑抗体本身的非特异性吸附，如确有较高的非特异性结合，应更换所用抗体原料；

  
  

Q10：单抗和多抗偶联微球有什么区别？

•  A10：（1）在胶乳比浊的试剂中，如选择使用多抗进行偶联，更易抓取到所有的抗原，但是多抗的批间差比较大，对于偶联后的试剂性能存在不确定性；

  （2）若用两株及以上单抗进行偶联，虽然单抗比多抗的特异性更好，批间差更小，但是单抗与抗原的结合能力相对较慢，会导致整体的反应速率偏慢，可能需要更高的抗体用量或更多株抗体提供不同的结合位点。

  
  

Q11：如何对微球进行取样和分装？

• A11：小粒径微球分散在含有抑菌剂的去离子水中，形成宏观上的均一乳液。为保证长期存储稳定性，微球乳液通常在2-8°C下保存。微球由于重力作用会缓慢沉降，为保证结果的可重复性，应按照标准操作规程对微球进行取样和分装，请参考《User Guide 304-PolymStar®系列小粒径乳胶微球的取样与分装》。

  
  

  
  

Q12：清洗乳胶微球时可能会损失一部分微球，如何确定清洗之后的微球浓度？

• A12：在清洗乳胶微球后确定微球浓度，可以通过几种方法来实现：

  使用紫外-可见分光光度计：可以使用紫外-可见分光光度计来测定微球的浓度，通常需要建立一条标准曲线，通过测定清洗后的微球溶液的吸光度来计算溶液中实际的微球浓度。

  使用纳米粒度分析仪：纳米粒度分析仪（纳米库尔特）可以测定微球的粒径分布，并且有些设备能够提供微球的数量信息。

  使用重量法：通过测量一定体积的微球溶液干燥后的重量，可以计算微球的浓度。

  每种方法都有其优势和局限性，选择哪种方法取决于微球的特性、可用的设备以及所需的精度。在实际操作中，可能需要结合多种方法来确保结果的准确性。

  
  

Q13：如何确定胶乳试剂的最佳保存pH？

• A13：胶乳试剂的最佳保存pH应避免极端pH值，因为极端的酸性或碱性pH会导致羧基或氨基去质子化，从而影响微球表面的蛋白活性以及官能团的解离程度，影响试剂的性能和存储稳定性，一般建议保存pH为6-8，保存时应考虑所偶联蛋白的等电点，尽可能远离等电点以保证微球表面有足够的斥力来维持稳定。

  
  

Q14：如何解决胶乳增强免疫比浊试剂的基质效应？

• A14：胶乳增强免疫比浊试剂的基质效应是指样品中存在的一些成分非特异性地影响试剂的浊度，从而干扰检测结果的准确性。为了解决这一问题，可以采取以下几种策略：

  优化抗原、抗体和胶乳微球的选择：选择特异性好、亲和力高的抗原和抗体，以及适当粒径的胶乳微球，可以提高检测的特异性和灵敏度。

  控制反应条件：包括pH值、温度、反应时间、离子强度等，这些条件的优化有助于减少非特异性反应，提高检测的准确性。

  使用阻断剂：在偶联反应后使用阻断剂，如牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白或其他适当的物质，可以减少微球与非目标分子的非特异性结合。

  优化抗体的偶联：通过调整活化剂的用量和偶联时间，确保抗体与微球的高效偶联，避免因偶联不充分导致的聚集现象。

  选择合适的缓冲液：使用适当的缓冲系统，避免使用会降低偶联试剂活性或促进非特异性结合的缓冲液，如磷酸盐和醋酸盐缓冲液可能会降低碳二亚胺的反应活性。

  通过上述措施，可以有效减少胶乳增强免疫比浊试剂的基质效应，提高检测结果的准确性和可靠性。

  
  

Q15：如何确定蛋白的等电点？

• A15：等电点的确定对于理解蛋白的稳定性、溶解性和生物活性非常重要，因此在蛋白质工程和生物制药领域中是一项关键的分析步骤。确定蛋白的等电点（pI）可以通过几种方法进行：

  理论计算：可以使用在线工具，如Expasy的Compute pI/Mw工具，输入蛋白的序列信息可计算其理论等电点。但该方法需要知道知道蛋白的氨基酸序列，然后进行预测。

  等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing，IEF）：这是一种实验室常用的技术，通过在具有pH梯度的凝胶中分离蛋白质，根据其等电点进行分析。在IEF过程中，蛋白会迁移至与其等电点相等的pH区域，在该区域蛋白的净电荷为零，停止迁移。

  
  

Q1：用于免疫层析的微球，一般粒径是多少纳米？

• A1：用于免疫层析的微球粒径一般为100-400 nm之间，最常用的是粒径为200 nm和300 nm的微球。

Q2：不同的层析项目，如何挑选合适的粒径？

• A2：一般而言，微球粒径越小，微球释放越完全，反应越充分，有助于提高结果的线性；微球粒径越大，信号值越高，可以提高灵敏度。客户可根据项目的具体性能需求来选择合适粒径的微球。

  
  

Q3：时间分辨荧光微球与普通荧光微球相比有什么区别，优势体现在哪些方面？

• A3：相比普通荧光微球，时间分辨荧光微球含有稀土元素，荧光半衰期较长；时间分辨荧光微球激发波长与发射波长间隔较远，Stokes位移大；提高了检测准确性和灵敏度。因此，时间分辨荧光微球较普通荧光微球有很大的优势。

  
  

Q4：纳微用于层析的微球，使用前需要清洗吗？

• A4：纳微用于层析的微球使用前不需要清洗。

  
  

Q5：纳微的荧光微球稳定性如何？

• A5：以纳微时间分辨荧光微球为例，在1%（w/v）浓度介质为水的存储条件下，两种时间分辨荧光微球的荧光强度在37 ℃ 15天的时间内，对初始值的百分比始终保持在95%以上，同时荧光强度没有出现随时间下降的趋势，说明微球的荧光强度在37 ℃条件下的热加速稳定性良好。

  以纳微时间分辨荧光微球制备的PCT检测试纸条为例，在37 ℃加速一周后其特异性、重复性、灵敏度均与在室温下放置一周的试纸条相似，说明微球制备的层析试纸条具有良好的稳定性。

  
  

Q6：批间差如何控制，不同批次间粒径CV多大？

• A6：微球批间差通过以下三个方面控制：

  （1）关键原料批量大，保证种子球和染料质量稳定；

  （2）采用标准工艺制备和染色；

  （3）最终产品经过严格理化检测和应用检测。

  不同批次间粒径CV均不超过5%。

  
  

Q7：用彩色微球，其灵敏度是否一定能高于胶体金？

• A7：用于免疫层析的彩色微球粒比胶体金大（彩色乳胶微球粒径在200-400 nm，胶体金粒径在20-40 nm），颜色深，其对应的灵敏度高于胶体金。

  
  

Q8：微球的粒径与NC膜孔径的对应关系？

• A8：微球的粒径小或NC膜的孔径大，标记物通过NC膜的速度越快，与包被在T线的抗体反应时间短，灵敏度也就越低。反之，微球的粒径大或NC膜的孔径小，反应时间长，灵敏度越高。但是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，客户可根据项目的具体性能需求选择合适粒径的微球和合适的NC膜孔径。

Q9：荧光微球单批次产能可达多少L？

• A9：时间分辨荧光微球单批次产能可达3.6 L*1%。

  
  

Q10：用于层析的彩色微球，有哪几种颜色可进行选择？

• A10：用于层析的彩色微球有红色和蓝色两种颜色可以选择。

  
  

Q11：彩色微球（红球）制备的试纸条出现堵膜，褪板不干净，底板红，如何解决？

• A11：当微球由于各种原因出现团聚，分散性下降，扩散速率减慢，就容易出现堵膜，进而导致背景颜色的产生，甚至可能会出现假阳性等问题。因此，保证微球在整个使用过程中的分散性良好，使微球能够顺畅通过膜孔，是避免膜面存在背景颜色难以褪去这一现象的根本办法。

  改善微球分散性主要通过优化两个过程的参数来实现，其一是微球偶联蛋白的过程，其二是偶联完蛋白后干燥喷垫的过程。第一个过程的优化可参考文档《TN003：EDC/Sulfo-NHS两步法共价偶联抗体条件的优化》。在第二个过程中，可以优化的的参数包括：

  1）微球喷垫的浓度。过高的微球用量不但会导致膜面背景颜色的产生，还有可能带来假阳性。

  2）微球偶联后的分散缓冲液。可以加入适当的蛋白或表面活性剂，但注意不要过量，否则可能影响免疫相互作用。

  3）微球偶联后的分散方式。适当增加超声分散的功率或者延长超声分散的时间都有助于解决此问题。

  
  

Q12：试纸条出现非特异性吸附的原因是什么？该如何解决？

• A12：试纸条出现非特异性吸附的原因很多，有偶联工艺、包被浓度、抗体本身等因素。

  1）可对偶联工艺进行优化或更换孔径较大的NC膜。偶联工艺可减少标记抗体用量、优化偶联条件如延长封闭时间或适当增加封闭蛋白含量等。

  2）可对包被液成分进行优化，通过降低包被浓度或适当增加包被液中的蛋白含量等。

  3） 考虑抗体本身的原因。

  
  

Q13：活化过程中EDC和NHS用量如何确定？

• A13：EDC的活化浓度与微球的表面羧基含量相关，应根据微球厂商提供的表面羧基含量计算EDC和NHS的合适反应浓度，一般按照微球表面羧基含量的1.0~1.5倍EDC用量即可。NHS的用量一般为EDC用量的0.5~10倍。不足量的EDC和NHS易导致羧基不能充分活化，而过量的EDC和NHS较难在后续步骤中清洗干净，进而可能影响偶联反应。

  
  

Q14：如何判断微球活化的时候的缓冲体系是否适合？

• A14：EDC和NHS在对羧基官能团进行活化后生成的两种活性中间体会和氨基反应，因此不能使用含有氨基或羧基的活化体系如醋酸、甘氨酸、Tris、咪唑等；缓冲体系的pH值在4.5~7.5之间活化效果最好，使用MES或PBS缓冲液可用于在反应过程中稳定pH值，其中50 mM pH6的MES缓冲液最为常用。

  
  

Q15：羧基微球用EDC进行活化后是否可以放置过夜再加入抗体进行偶联反应？

• A15：不可以，建议微球活化之后立即加入抗体进行偶联反应，长时间的放置会使活化的基团发生水解。

Q16：抗体偶联量一般怎么确定？

• A16：以LFTNC-020时间分辨荧光微球为例，羧基密度20 Å2 ，1 mg微球结合0.2 mg抗体；以LFTNC-030时间分辨荧光微球为例，羧基密度20 Å2 ，1 mg微球结合0.1 mg抗体。用户可根据具体情况适当减少偶联抗体用量。

Q17：离心和超声对微球有什么影响？使用哪种超声方式更好？

• A17：以LFTNC-020时间分辨荧光微球为例，针对此项验证结果表明：（1）无论是先离心后用水稀释、先用水稀释后离心这两种情况下微球均能够离心完全，易重新悬浮，SEM测试微球形貌无变化，未出现微球挤压变形及破裂等情况。（2）在探头式超声下，设置功率30%，超声5 s停5 s，超声时间1 min-3 min后，SEM测试微球形貌无变化，未出现微球挤压变形及破裂等情况。在使用水浴超声时由于超声力度较小，需找到超声能量最强的位置，并适当延长超声时间，才能尽可能使微球分散均匀。若试验条件允许情况下建议采用探头式超声，从DLS数据来看微球分散均匀，用户可根据具体情况适当调整超声条件。

  
  

Q1: 什么是荧光淬灭？它和光漂白是一样的吗？

• A1: 两者不一样。荧光淬灭是光淬灭(quench)是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用 造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。外部因素则包含多方面，主要有：光照射是致荧光淬灭的最常见原因，荧光的产生需要光照射，但同时光照射也会促进激发态分子与其他分子相互作用而引起碰撞，使荧光淬灭； 荧光物质的分子与外部分子(或离子)形成非荧光的化合物；共振能量的转移；溶剂种类、pH 值及温度等环境条件。光漂白(Photobleaching)是染料或荧光团分子的光化学变化，使其永久不能发出荧光。这是由于共价键断裂或荧光团与周围分子之间的非特异性反应。

  
  

  
  

Q2：我要进行免疫试剂开发，羧基微球的偶联工艺？

• A2: 微球表面性质：COOH微球表面更亲水，微球本身分散性好，对于蛋白的非特异吸附相对较低； 偶联工艺：COOH微球需要用EDC或EDC+Sulfo-NHS等交联剂进行活化，活化后的产物不太稳定易水解，需立即和抗体或抗原进行偶联，一般在弱酸-中性pH下进行活化和偶联，偶联反应时间为12-14 h。由于EDC和Sulfo-NHS容易水解，且活化产物与氨基的反应速度很快，在工艺放大中容易出现较大的批间差。

  
  

  
  

Q3：CytomStarYES系列微球表面的羧基基团含量是如何测定的？

• A3：羧基含量通过电导率滴定法测定。我们制定了严格的标准操作流程确保测试结果的可重复性。

Q4：CytomStar系列微球的数量浓度是采用什么方法确定的？

• A4：我们是采用流式细胞仪中的绝对计数功能进行定值的。为了保证计数的准确性，每周使用BD计数管对机器进行验证，保证数据的准确性。

Q5：在偶联完抗体后微球会有些团聚，这个是为什么？有什么解决方案？

• A5：微球表面是做过亲水包覆的，微球本身的分散性好，偶联完抗体后微球表面性质发生了变化，微球的亲疏性是由抗体的亲疏水性决定的；可以在偶联的Buffer里加入适量的表面活性剂，也可以适当的减少抗体的投入量。

  
  

  
  

Q6： 抗体与微球偶联后，使用过程避免发生非特异性吸附的最好方法是什么？

• A6: 1.将抗体吸附到微球上并用 BSA、明胶或其他蛋白进行封闭处理，但这种方法并不能保 证其他蛋白也不被吸附；2.通过共价偶联的方法可以将抗体永久的结合到羧基修饰的微球表面。然后加入适量（1-5%）的含有封闭蛋白或不含有封闭蛋白的表面活性剂如Tween-20。表面活性剂的量可以根据实际需要增加直到不发生非特异性吸附为止，由于是共价偶联因此不必担心抗体会从微球上脱落。

  
  

  
  

Q7：CytomStarYES系列微球，使用前是否需要清洗，如何清洗？

• A7：纳微COOH微球保存在0.01% Tween-20＋0.05% Proclin-300的去离子水中。使用前建议客户进行清洗置换Buffer。清洗方法：①将微球从冰箱中取出，置于血液混匀仪上混匀至少30 min，用移液枪移取所需使用的微球；②离心除去上清液；③加入对应体积的缓冲液（客户的微球稀释液或洗涤液），涡旋混匀（大量则需要搅拌混匀）后水浴超声1分钟，超声功率为40 kHz；④按②③步骤的方法清洗微球三次，最后将微球置换至客户需要的缓冲液中。

  
  

  
  

Q8：CytomStarYES系列微球，不同批次间微球的荧光强度的批间差是多少？保质期多久？

• A8：不同批次间微球的荧光强度的变化在±10%以内，（2-8℃保存）保质期24个月。针对这个保质期做过24个月在2-8℃保存条件下的实时稳定性的测试。